电针干预放射性脑损伤小鼠海马区突触可塑性相

2021/05/01

0 引言 Introduction

放射疗法在控制疾病的进程中有重要意义,但放射线治疗引发的脑部损伤也不容忽视[1]。放射性脑损伤是放疗引发的并发症之一,严重危害人类的健康,可降低患者生活质量[2]。放射性脑损伤的严重程度与放射剂量呈正相关[3] Gy的X射线辐射可对Long-Evans大鼠学习记忆能力产生影响[4],课题组前期研究同样发现8 Gy以上放射剂量即可造成C57BL/6J小鼠出现认知功能损伤[5]。动物实验发现电针干预可改善阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆功能,但其具体机制尚不明了[6]。此外,Notch信号通路对神经干细胞增殖具有调控作用,并且Notch信号通路与海马突触可塑性以及学习记忆密切相关[7-8]。因此,该研究采用电针干预放射性脑损伤小鼠“百会”“风府”及双侧“肾俞”穴,观察电针对放射性脑损伤小鼠学习记忆的影响,检测海马区Notch通路相关蛋白及突触可塑性相关蛋白表达变化,探讨电针对放射性脑损伤的保护作用机制。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2019年4至6月在河南中医药大学动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 30只SPF级30 d龄C57BL/6J雄性小鼠,体质量10-13 g,购于北京维通利华生物科技有限公司,许可证号为SCXK(京)2016-0006,实验单位许可证号为SYXK(豫)2015-0005。将实验动物随机分为空白组、模型组和电针组,每组10只。该实验已通过河南中医药大学伦理委员会批准(动物伦理审查批准编号为DWLL)。将小鼠置于7:00- 19:00光照和19:00 -7:00黑暗的实验室,水食不限,室温20-25 ℃,湿度为50%-60%。

1.3.2 实验用主要仪器与试剂 一次性针灸针(苏州医疗用品厂0.30 mm×13 mm);电子针灸治疗仪(无锡佳健医疗器械股份有限公司,型号G6805);全自动Morris水迷宫设备(淮北正华生物仪器设备有限公司,型号SC-b5);体视学显微镜(Leica,型号M205FA);直线加速器(Varian Clinac 600 CD,Radiation Oncology Systems,SanDiego,CA,USA);石蜡切片机(Leica,型号2235);LAS1000 CCD曝光检测系统(Fujifilm,Tokyo,Japan); 抗 BrdU 单 克 隆 抗 体 (Abcam,ab895);BrdU(Servicebio,B8010);兔抗单克隆Notch1抗体(Abcam,ab);兔抗单克隆Hes1抗体(Servicebio,GB);突触素兔抗鼠多克隆抗体(武汉三鹰,-1-AP);脑源性神经营养因子兔抗鼠多克隆抗体(Servicebio,GB);突触后致密蛋白95兔抗鼠多克隆抗体(Servicebio,GB)。

1.4 实验方法

1.4.1 放射性脑损伤模型制备[4,9]将模型组与电针组C57BL/6J小鼠进行造模。腹腔注射2%戊巴比妥钠(0.01 mL/g)麻醉,将小鼠俯卧置于放射平台进行X射线照射,照射剂量为单次8 Gy,射线源距离脑99.5 cm,剂量率为400 cGy/min,照射过程持续约10 min。脑组织接受剂量的变异约±5%,造模结束后次日每组10只小鼠进行T迷宫及水迷宫行为学测试进行模型评估,测试后每组随机筛选6只小鼠进行后续的电针干预等操作。

1.4.2 电针干预方法 用小鼠固定器将小鼠俯卧位固定于操作台上,取穴方法参考《实验针灸学》[10]。电针穴位取百会(顶骨正中)、风府(枕骨顶嵴后枕寰关节背凹陷处)及肾俞(第2腰椎后两旁凹陷处)。回路1取百会和风府,回路2取双侧肾俞。用一次性无菌针灸针刺入深度约为1 mm,连接电针仪设置电压1.5 V,频率10 Hz,波宽1 ms,针刺时间为20 min/次,1次/d,连续针刺21 d。每日电针干预后各组小鼠以0.01 mL/g腹腔注射5 g/L胸腺嘧啶衍生物BrdU。模型组和空白组不进行电针干预,但模拟抓取与固定。电针干预结束后次日开始行为学测试。

1.4.3 T迷宫实验 在迷宫两臂碗里放入食物,将小鼠放入T迷宫适应2 d,训练时将T迷宫的左臂闸门打开,右臂关闭,小鼠只能进入右臂获取食物,15 s后撤去所有闸门,两臂全部打开后将小鼠放入开始臂中,若小鼠选择未曾进入的臂为正确选择,反之为错误选择。每只动物每天进行4次训练,每次间隔15 min,连续4 d。随后进行测试,记录每组小鼠的错误次数。

1.4.4 水迷宫实验 T迷宫实验结束后进行水迷宫测试,圆形水池直径为120 cm,高40 cm,水池内放一直径10 cm,高25 cm的圆形平台,将圆形水池任意等距离的分为(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)4个象限,并将圆形平台置于其中1个象限。开始往水池注水,水深约30 cm,水温控制约25 ℃,水面高于平台约1 cm,然后倒入脱脂奶粉使水不透明。系统跟踪分析软件自动记录游泳路线。定位航行实验为前6 d,记录其逃避潜伏期,第7天撤去平台,记录其穿越平台次数和目的象限停留时间。

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